荧光标记如何帮助确定核苷酸序列

DNA测序是一种有助于确定特定DNA分子核苷酸序列的技术。两种测序方法是Sanger测序和二代测序。两种类型的测序方法都是最新的全自动。任何 DNA 链都由四种核苷酸组成：腺嘌呤 (A)、鸟嘌呤 (G)、胞嘧啶 (C) 和胸腺嘧啶 (T)。 在两种测序方法中，DNA 片段中的核苷酸都用四种独立的荧光标记物标记。 荧光标记或荧光团是能够吸收光并以明确定义的波长发射光的分子。荧光标记物通过 PCR 结合到 DNA 链中。然后通过自动化技术确定核苷酸的序列。

涵盖的关键领域

1.什么是测序 – 定义、Sanger 测序、下一代测序 2. 荧光标记如何帮助确定核苷酸序列 – 测序程序

关键词：双脱氧核苷酸 (ddNTPs)、荧光标记、凝胶电泳、下一代测序、核苷酸序列、PCR、Sanger 测序

什么是测序

测序是一种实验室技术，用于确定 DNA 分子的核苷酸序列。两种主要类型的 DNA 测序方法可以确定为 Sanger 测序和下一代测序。 Sanger 测序和下一代测序都使用带有荧光的标记核苷酸来确定核苷酸序列。

桑格测序

Sanger 测序是最早开发的 DNA 测序方法。测序方法最早由 Fredric Sanger 于 1975 年开发。因此，它被称为 Sanger 测序。桑格测序法也称为 链终止法 因为它参与体外 DNA 合成过程中 DNA 聚合酶选择性掺入链终止双脱氧核苷酸 (ddNTPS)。 DNA 链的延长是通过常规脱氧核苷酸 (dNTP) 实现的。然而，ddNTPs 被添加到反应混合物中以终止链增长。这些 ddNTP 是荧光标记的。将四种类型的 ddNTP 添加到四种单独的 PCR 混合物中。因此，通过添加 ddATP、ddGTP、ddCTP 和 ddTTP 进行四个单独的 PCR 反应。在每个反应混合物中，链增长分别在每个 A、G、C 和 T 核苷酸处终止。例如，在添加了 ddATP 的反应混合物中，不同扩增子的生长在 DNA 片段中的每个 A 核苷酸处终止。然后，通过凝胶电泳分离这四个反应，并使用荧光计扫描分离的荧光。 Sanger测序广泛用于DNA克隆所用片段和PCR扩增片段的序列测定。确定的核苷酸序列见图1。

图 1：DNA 序列

下一代测序

最新的 DNA 测序技术统称为下一代测序。测序反应一次在芯片上以微尺度进行。因此，多个测序反应并行进行。在下一代测序中，毛细管电泳除凝胶电泳外还用于分离链终止法产生的不同长度的扩增子。毛细管电泳是一种分析分离方法，根据分子的电泳迁移率分离分子。

荧光标记如何帮助确定核苷酸序列

在测序过程中，待测序的 DNA 作为 DNA 合成的模板链。 DNA 引物用于通过 DNA 聚合酶启动 DNA 合成。添加常规四种碱基（dNTP；dATP、dGTP、dCTP、dTTP）和四种双脱氧核苷酸（ddNTP；ddATP、ddGTP、ddCTP 和 ddTTP）之一的低水平混合物作为 PCR 反应的组分。因此，通过添加四种 ddNTP 中的每一种来进行四个单独的 PCR 反应。双脱氧核苷酸具有两个特殊的特性：

它们缺少 3'-OH 基团，DNA 聚合酶将进入的核苷酸添加到该基团上。因此，ddNTP 的掺入终止了链增长。
它们用不同的荧光染料标记： ddATP 用绿色染料标记，这 ddGTP 用黄色染料标记，这 ddCTP 标有蓝色，以及 ddTTP 用红色染料标记.

然而，链终止的ddNTPs以低浓度加入；它们不会立即终止整个 PCR 过程。但是，当四种 ddNTP 中的一种并入正在增长的链中时，该特定链的增长就会终止。所以，在每四个 PCR 反应结束时，会产生一系列扩增子（通过 PCR 产生的 DNA 片段），它们在目标 DNA 片段的每个核苷酸处终止。这些扩增子可以在凝胶中运行。在电泳凝胶的特定点处通过的荧光染料可以通过荧光计进行扫描，以确定自动 DNA 测序仪中的核苷酸序列。 DNA测序得到的荧光标记核苷酸序列如图2所示。