测序是确定特定 DNA 片段的核苷酸序列的过程。在测序过程中，DNA 片段通过 PCR 用荧光标记的核苷酸进行末端标记。该过程使用四种类型的荧光标记核苷酸，它们是双脱氧核苷酸 (ddNTPs)。 ddNTPs 缺少 3' OH 基团，传入核苷酸的磷酸基团与该基团相连。因此，当 ddNTP 添加到增长链时，在链的 3' 端将不再添加核苷酸。这意味着将 ddNTP 添加到增长链中会终止链增长。由于 ddNTP 以低浓度添加到 PCR 混合物中，因此每条生长链都以不同的水平终止。检测发射荧光以确定 PCR 结束时 DNA 片段的核苷酸序列。

涵盖的关键领域

1.什么是DNA测序 – 定义、类型 2. DNA 测序如何工作 – DNA测序过程

关键词：双脱氧核苷酸 (ddNTPs)、荧光标记、凝胶电泳、下一代测序、核苷酸序列、PCR、Sanger 测序

什么是DNA测序

DNA 测序是一种实验室技术，用于确定特定 DNA 分子的核苷酸序列。它使用荧光标记的核苷酸，在 PCR 过程中掺入。基于用于检测荧光的技术，有两种主要的测序方法：Sanger 测序和二代测序。

桑格测序

桑格测序由 Fredric Sanger 于 1975 年开发，是最早开发的测序方法。它也被称为 自链终止法 它参与体外 DNA 合成过程中链终止 ddNTP 的选择性掺入。在 Sanger 测序中，扩增子通过凝胶电泳分离。 Sanger测序广泛用于确定克隆中使用的DNA片段和PCR扩增的片段的序列。确定的 DNA 序列如图 1 所示。

图 1：DNA 测序

下一代测序

大多数最新的 DNA 测序技术统称为下一代测序。它也是一种链终止方法。下一代测序使用毛细管电泳分离链终止法产生的不同长度的扩增子。下一代测序用于确定每次运行的大量核苷酸，例如基因组测序。

DNA测序如何工作

在 DNA 测序过程中，荧光标记的核苷酸通过 PCR 被添加到特定的 DNA 片段中。为了延长 DNA 链，使用常规脱氧核苷酸 (dNTP)。然而，ddNTPs 被添加到反应混合物中，它是荧光标记的。由于 ddNTP 在脱氧核糖分子中没有 3' OH 基团，因此可能不会发生进一步的链增长，从而终止链增长。 DNA 的糖磷酸骨架是通过脱氧核糖的 3' OH 基团和传入核苷酸的磷酸基团之间形成磷酸二酯键而形成的。然而，ddNTPs 以低浓度添加；因此，它们不会立即终止链增长。

将四种类型的 ddNTP 添加到四种单独的 PCR 混合物中。通过添加 ddATP、ddGTP、ddCTP 和 ddTTP 进行四个独立的 PCR 反应。因此，在每个反应混合物中，链增长分别在 A、G、C 和 T 核苷酸处终止。例如，在添加了 ddATP 的反应混合物中，不同扩增子的生长在 DNA 片段中的每个 A 核苷酸处终止。 Sanger测序法测定DNA序列见图2。

图 2：桑格测序

四种核苷酸中的每一种都用单独的荧光颜色标记；这 ddATP 用绿色染料标记； 这 ddGTP 用黄色染料标记； 这 ddCTP 标有蓝色； 这 ddTTP 用红色染料标记.因此，四个 PCR 反应的扩增子以不同的颜色标记。

扩增感兴趣的 DNA 片段后，通过凝胶电泳或毛细管电泳分离扩增子。 DNA片段的核苷酸序列可以通过检测发射荧光来确定。通过 Sanger 测序，可以轻松确定每次运行的 750-1, 000 个碱基对长片段的核苷酸序列。然而，由于基因组中有大量核苷酸，因此确定整个基因组的核苷酸序列仍然具有挑战性。然而，下一代测序技术，如 454 测序，每次运行可以读取大约 2000 万个碱基对。

结论

DNA测序是一种用于测定DNA片段核苷酸序列的分子生物学技术。在测序过程中，通过 PCR 将荧光标记的核苷酸添加到 DNA 片段中。通过检测发射荧光，可以确定核苷酸序列。

参考：

1. “DNA 测序”。可汗学院，可在此处获得。

图片提供：

1. Sjef 的“DNA 序列”——自己的作品，公共领域）通过 Commons Wikimedia 2. Christoph Goemans 的“Didesoxy-Methode”（修改者）——Norman Mauder 博士，auf Basis einer Datei von Christoph Goemans（CC BY-SA 3.0） ）通过Commons Wikimedia