如何设计 QPCR 引物
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定量或实时 PCR 被用作常规检测，用于监测不同实验条件下基因表达的相对变化。 QPCR 过程中引物和探针的设计是影响检测质量和成功的最关键因素之一。 QPCR引物的设计有几条准则适用：引物的GC含量应为35-65%；引物的熔解温度应在60-68°C之间；还应避免二级结构、长度超过 3 个碱基的 Gs 或 Cs 重复以及引物二聚体的形成。
涵盖的关键领域
一、什么是QPCR – 定义、过程、用途 2. 如何设计 QPCR 引物 – QPCR 引物设计指南
关键术语：荧光染料、GC 含量、熔解温度、引物、定量 PCR (QPCR)
什么是 QPCR
QPCR 是一种允许实时定量产物的 PCR。荧光染料可用于通过在每个步骤中标记 PCR 产物来定量 PCR 产物。 QPCR 分析可以使用两种荧光标记方法。它们是使用荧光染料和荧光标记的探针。荧光染料与 PCR 产物结合，而探针与 PCR 产物退火形成稳定的三链 DNA。 QPCCR中广泛使用的荧光染料是SYBR Green，而探针可以是Taqman。在 QPCR 过程中使用探针检测 PCR 产物可提供更准确的结果并提高检测的灵敏度。
图 1：QPCR 的机制
如何设计 QPCR 引物
QPCR 引物的设计对于提高检测的可靠性、准确性和灵敏度至关重要。 QPCR 引物设计指南如下所述。
- PCR 产物/扩增子大小——PCR 产物的大小应为 50-210 个碱基对。
- 引物长度——引物长度应为 19-23 个核苷酸。
- GC 含量——引物的 GC 含量应为 35-65%。
- 熔解温度 (Tm) – 引物的熔解温度应为 60-68 °C。该测定的退火温度比引物的 Tm 低 5°C。
- 外显子-外显子连接——通过 QPCR 扩增 cDNA 时，引物应跨越外显子-外显子连接以避免污染 DNA 的扩增。
- 重复和运行 – 应避免二核苷酸重复 (TCTCTCTCTC) 和重复核苷酸（例如 TAAAAAAAGC）。
- 3' 互补——应避免正向和反向引物 3' 末端的互补区域，以防止形成引物二聚体。
- 3' 稳定性 – G 或 C 残基应包含在引物的 3' 末端以增加退火的稳定性。
- GC 夹 – 引物 5' 端的一个或两个 GC 夹可提高退火的特异性。
- 特异性——引物的特异性应通过 BLAST 检查
- SNP – 引物不应包含任何已知的 SNP（单核苷酸多态性）变异
QPCR 的引物设计中可以使用多种在线工具，例如 Primer3、Primer-BLAST、IDT PrimerQuest、Primer Bank 和 OAT。
图 2：引物二聚体的形成
引物的设计应避免在 QPCR 中形成引物二聚体。使用荧光染料检测 PCR 产物时至关重要，因为这些染料还会与引物二聚体结合，从而产生假阳性结果。
结论
QPCR 用于 PCR 产物的检测和定量。引物的设计在 QPCR 中对于提高结果的准确性至关重要。因此，在设计 QPCR 引物时仔细遵循指南非常重要。
参考：
1. “QPCR 检测设计和优化”。 LSR | Bio-Rad，可在此处获得。
图片提供：
1. 用户的“Taqman”：Braindamaged – 原始上传者（公共领域）通过 Commons Wikimedia2 拥有的作品。 Tzachi Bar 的“引物二聚体形成 En” – 通过 Commons Wikimedia 自己的作品（CC BY-SA 3.0）
