定点诱变 (SDM) 是一种在已知序列中产生突变的体外方法。它通常通过基于 PCR 的方法进行。通常，在定点诱变中改变一或两个碱基。可以设计带有所需突变的引物，以便对核苷酸序列进行微小的改变。引物延伸和反向 PCR 可用于引入大规模突变。这种方法可能会改变特定蛋白质的氨基酸组成。定点诱变用于研究蛋白质活性的变化。它还用于创建融合蛋白。

涵盖的关键领域

1. 什么是定点诱变 (SDM) – 定义、角色、方法 2. 如何设计用于定点诱变的引物 – 替换、删除、插入

关键术语：删除、插入、突变、定点诱变、替代、传统 PCR

什么是定点诱变

定点诱变是一种分子生物学技术，用于对基因的核苷酸序列引入特定的变化。它用于改变蛋白质的氨基酸序列，引入或去除限制性位点，破坏转录结合位点，并创建融合蛋白。

过程

在定点诱变期间，使用由所需突变组成的引物将突变引入质粒。整个模板通过 PCR 扩增，将突变整合到模板中。然后，使用酶、甲基化依赖性核酸内切酶从样品中去除母模板。带有所需突变的 PCR 产物或带切口的质粒分子被转化到细菌中。可以从具有所需修饰的细菌中分离质粒。定点诱变过程如图1所示。

图 1：定点诱变

三种主要类型的方法用于在定点诱变中引入所需的突变。它们是传统的 PCR、引物延伸和反向 PCR。引物延伸和反向 PCR 可用于引入大规模核苷酸变化。

传统PCR

传统 PCR 可用于通过修饰引物向目标序列引入一个或两个核苷酸变化。变化可以是核苷酸取代、缺失或添加。该突变在 PCR 过程中被整合到扩增子中。因此，原始序列被引物中的突变序列取代。

引物延伸

在引物延伸中，所需的突变是在嵌套 PCR 过程中掺入的。在这里，目标序列的两侧是两个引物。所需的突变被掺入内部引物，并在第二轮 PCR 中引入突变。通常，PCR 反应的特异性随着引物中错配核苷酸数量的增加而降低。然而，具有大规模突变的长内部引物可用于引物延伸，因为巢式 PCR 可以增加 PCR 反应的特异性。

反向PCR

反向 PCR 是一种通过设计已知 DNA 序列的引物来扩增未知 DNA 片段的方法。它可用于大规模替换、删除或插入核苷酸。

定点诱变的应用描述如下。

1. 研究蛋白质的结构、功能和催化特性
2. 改善蛋白质的特性（蛋白质工程）
3. 引入或去除限制性内切酶位点。

如何设计用于定点诱变的引物

定点诱变是通过引物引入所需突变的过程。突变可以是替换、插入或删除。由于PCR的特异性随着引物中错配核苷酸的增加而降低，因此传统的PCR只能将一两个碱基对引入目标序列。其他方法如引物延伸和反向 PCR 可用于引入大规模突变。定点诱变中的引物设计如图2所示。

图 2：用于定点诱变的引物

代换

对于替换，两个引物之一应在引物中间包含所需的突变。在这里，包含突变的位点不会与目标序列退火，因为它会形成扭曲。

删除

对于删除，在引物设计过程中可以忽略要从目标中删除的序列。由于该序列与引物的侧翼区域分开，因此它不会在 PCR 过程中被扩增。

插入

对于插入，要添加的序列在引物设计过程中与其中一个引物的 5' 末端缠结。因此，插入的序列也可能与扩增子保持连接。

结论

定点诱变是一种用于将突变引入 DNA 序列的技术。这些突变可以是替换、插入或缺失。在传统的 PCR 中可以引入小规模的突变。可以在引物延伸或反向 PCR 中引入大规模突变。突变的引入是通过将所需突变掺入引物来完成的。

参考：

1.“定点诱变方法。”集成 DNA 技术，可在此处获得。

图片提供：

1. Knbusby 的“站点定向诱变” – 通过 Commons Wikimedia 自己的作品（公共领域）