如何从总 RNA 中分离 mRNA

信使RNA（mRNA）是转录的产物，由一系列RNA核苷酸组成。它携带基因中的信息从细胞核到细胞质以合成蛋白质。从特定细胞系中分离 RNA 会产生总 RNA，它由 rRNA 和 tRNA 以及 mRNA 组成。因此，在研究细胞系的转录组时，应将 mRNA 从总 RNA 混合物中分离出来。 mRNA 的独特特性，例如在 mRNA 分子的 3' 末端存在聚 (A) 尾，用于分离。由于 oligo-dT 分子与 poly(A) 尾部互补，因此可以从总 RNA 的混合物中分离出 mRNA。

涵盖的关键领域

1.什么是mRNA – 定义、结构、功能 2. 总RNA的组成是什么 – mRNA、rRNA、tRNA 3. 如何从总 RNA 中分离 mRNA – 使用 Oligo-dT/载体分子

关键术语：亲和层析、信使 RNA (mRNA)、减法、Oligo dT、Poly(A) 尾、总 RNA

什么是mRNA

mRNA是蛋白质编码基因的转录物。它在真核生物的细胞核内产生，并携带用于将特定蛋白质产生到细胞质中的信息。在核糖体的协助下，它在翻译过程中被翻译成蛋白质的氨基酸序列。真核生物转录产生的初级转录物称为前体 mRNA。

图 1：mRNA 结构

在转录后修饰过程中，会产生具有多种特征的成熟 mRNA 分子，例如 5' 帽和 poly(A) 尾。特定生物体的总 mRNA 称为其转录组。

总RNA的组成是什么

RNA分离的结果称为总RNA。它由细胞产生的所有三种主要类型的 RNA 组成。它们是 mRNA、tRNA 和 rRNA。 tRNA 和 rRNA 都有助于翻译。真核mRNA的大小为0.5-20 kb。转移 RNA (tRNA) 在翻译过程中带来相应的氨基酸。它长 76-90 个碱基对，由反密码子区组成，与 mRNA 上的特定密码子互补。核糖体 RNA (rRNA) 是核糖体的组成部分。一些人类 rRNA 的长度为 5 kb。

超过 90% 的总 RNA 由 tRNA 和 rRNA 组成。 mRNA 仅占总 RNA 的 1-5%。典型的哺乳动物细胞每个细胞可能包含大约 500, 000 个 mRNA 分子。特定类型的 mRNA 的数量可以是每个细胞 15-20, 000 个拷贝。

许多分子生物学技术，如 cDNA 文库构建、微阵列制备的样品制备、弱表达基因的 Northern 印迹分析等，都需要高质量的 mRNA。根据细胞类型，从总 RNA 中分离 mRNA 的方法主要有两种：mRNA 分离的直接法和 mRNA 分离的减法。

mRNA分离的直接方法

从真核总 RNA 中分离成熟 mRNA 的原理涉及使用与 poly(A) 尾部互补的 oligo dT（oligodeoxthymidylate）对聚腺苷酸化 mRNA 进行亲和选择/亲和层析。由于在其他两种类型的 RNA：tRNA 和 rRNA 中不存在 poly(A) 尾，这成为可能。

mRNA 的 poly(A) 尾部由 30-200 个腺嘌呤核苷酸组成。填充有 oligo dT/载体组合的亲和柱用于从总 RNA 中分离 mRNA。寡聚 dT/载体组合可以是纤维素结合的寡聚 dT、生物素化寡聚 dT 与链霉亲和素偶联的磁珠或寡聚 dT 偶联的聚苯乙烯-乳胶珠。所有的实验条件都应该在无 RNase 的条件下，以防止 RNA 的酶促分解。

图 2：亲和色谱

总 RNA 应溶解在高盐缓冲液中，并短暂加热至 65-70 °C，以破坏 RNA 的二级结构。分离 RNA 的条件因市售的 mRNA 分离试剂盒而异。然而，poly(A)-RNA 或 mRNA 的制备由三个步骤组成。

poly(A)-RNA 与连接到载体的寡聚 dT 分子的杂交
洗掉未结合的 RNA
在低严格条件下从 oligo-dT/载体组合中洗脱 poly(A)-RNA

mRNA分离的减法

基于 Oligo dT 的 mRNA 纯化仅产生带有 poly(A) 尾或成熟真核 mRNA 的 mRNA。因此，另一种称为减法的方法可用于纯化没有聚 (A) 尾的 mRNA。该方法可用于从酵母和细菌总 RNA 中分离 mRNA。它还可以用于从真核细胞中分离未成熟类型的 mRNA 和成熟的 mRNA。它涉及通过从总 RNA 中去除大核糖体 RNA 来富集转录组。 RiboMinus^TM值 ThermoFisher Scientific 的转录组分离试剂盒使用三个步骤从酵母和细菌总 RNA 中高效纯化 mRNA。

总 RNA 与 rRNA 序列特异性 5' 生物素标记寡核苷酸探针的杂交
去除 rRNA/5'-生物素标记的探针复合物以及链霉亲和素包被的磁珠
纯化杂质和洗脱 mRNA。

结论

总 RNA 由三种主要类型的 RNA 组成：mRNA、rRNA 和 tRNA。从总 RNA 中纯化 mRNA 对于分析特定生物体的转录组至关重要。纯化方法基于 mRNA 的类型。真核 mRNA 含有 poly(A) 尾，可以通过 oligo dT 亲和层析分离。可以通过从总 RNA 中去除大 rRNA 来分离来自酵母和细菌细胞的未成熟真核 mRNA 和 mRNA。

参考：

1.“mRNA提取”。 Thermo Fisher Scientific，可在此处获得。 2.“按RNA类型提取RNA”。 Thermo Fisher Scientific，可在此处获得。

图片提供：

1. 通过 Commons Wikimedia 的“成熟 mRNA”（CC BY-SA 3.0） 2. Jamit 在英语维基教科书上的“亲和力” – Adrignola 使用 CommonsHelper（公共领域）通过 Commons Wikimedia 从 en.wikibooks 转移到 Commons