如何制作 PCR 引物

引物是体内和体外 DNA 扩增的重要组成部分。在体内，DNA 聚合酶需要引物来启动 DNA 复制。在体外，引物主要用于聚合酶链反应（PCR）的启动。其他一些技术，包括测序、克隆、定点诱变等，需要引物。因此，体外技术引物的设计变得非常简单，但对分子生物学家来说却是一个具有挑战性的过程。因此，本文讨论了 PCR 和测序引物设计的基本规则。

涵盖的关键领域

1. 什么是引物 – 定义、类型、角色 2. 引物在 PCR 中的作用 – DNA的特征，PCR过程 3. 如何制作 PCR 引物 – 设计 PCR 引物的基本规则 4. 如何设计测序引物 – 测序引物的特点

关键词：DNA 合成、正向引物、长度、熔解温度、PCR、反向引物、测序引物

什么是引物

引物是 DNA 或 RNA 的短链，作为 DNA 合成的起点。催化 DNA 复制的酶能够将核苷酸添加到现有的 3' 端。因此，引物作为引物为 DNA 合成奠定了基础。 RNA引物 在细胞内用于通过 DNA 聚合酶启动 DNA 复制。然而，合成 DNA引物 可用于DNA的扩增，主要通过PCR等技术。 PCR 中使用两种类型的引物，它们被称为正向引物和反向引物。在 PCR 过程中，通过正向和反向引物连接基因组 DNA 中特定 DNA 序列的侧翼，可以产生数百万个拷贝的所需 DNA 片段。特定DNA序列侧翼的正向和反向引物如图1所示。

图 1：正向和反向引物

引物如何在 PCR 中发挥作用

DNA 是一种具有两条连接在一起的链的分子。碱基对模式与两条链中的每一条互补。两条链通过互补氮碱基之间的氢键连接在一起。此外，每条链都有自己的方向性。一条链具有 5' 到 3' 的方向性，而另一条链具有 3' 到 5' 的方向性。因此，两条链是反平行的。具有 5' 到 3' 方向的链称为有义链，而具有 3' 到 5' 方向的链称为反义链。在 PCR 过程中，应单独合成每两条链。

PCR的三个步骤是变性、退火和延伸。在变性过程中，DNA 的两条链通过加热至 95 °C 破坏氢键而分离。正向引物与有义链结合，而反向引物与反义链结合。当温度从 95°C 下降到 50-60°C 时，引物会发生退火。因此，可以在 Taq 聚合酶的帮助下同时合成两条链。有义链和反义链的扩增发生在 5' 到 3' 方向。由于 PCR 是一个指数反应，这三个步骤在 25-35 个循环中重复。每个循环中都使用正向和反向引物，以产生大约 2³⁵ 所需 DNA 片段的拷贝。引物在PCR中的作用如图2所示。

图 2：PCR

为了扩增基因组中的特定 DNA 片段，该特定 DNA 片段的两侧应该有正向和反向引物。因此，两种引物都应与 DNA 片段侧翼的序列互补。成功设计 PCR 引物的基本指南如下所述。

正向和反向引物的方向应为 5' 到 3'。
每个引物的长度应在 18 到 25 个核苷酸之间。
引物的 GC 含量在 40% 到 60% 之间，引物 3' 端的 C 或 G 的存在可能会促进结合。
引物对的熔解温度和 Tm（一半引物与模板退火时的温度）应相似且高于 60 °C。最大差异应为 5 °C。
引物的 3' 端应与模板 DNA 完全匹配。
引物 3' 末端的最后 5 个碱基中应至少存在 2G 或 C 碱基（GC 钳位）。 GC 钳会促进与目标序列的强结合。
可以在引物的 5' 端添加 5-6 个核苷酸的限制位点。
引物序列中应避免二核苷酸重复 (ATATATAT) 或相同核苷酸重复 4 次以上 (ACCCC)。这会导致错误启动。
应避免引物内同源性或引物的二级结构。应避免正向和反向引物中的引物间同源性或互补序列。这两种情况都可能形成自身二聚体或引物二聚体。
二聚体分析的 ΔG 值应在 0 到 -9 kcal/mole 之间。

许多在线工具可用于简化引物设计，例如 Primer 3、Primer X、NetPrimer、DNAstrar 等。设计引物的特异性可以通过 NCBI Primer-BLAST 或 UCSC in-silico PCR 等工具确定.

图 3：引物 3 界面

如何设计测序引物

测序引物很短，是 DNA 链，就像 PCR 引物一样。然而，PCR引物设计用于扩增特定DNA片段，而测序引物用于通过PCR揭示扩增DNA片段的核苷酸序列。与 PCR 引物不同，只要目标序列的长度小于 500 bp，就可以在测序中使用单个引物。例如，PCR 的正向引物可用于测序，以仅扩增有义链。此外，测序反应过程中容忍的错配程度高于 PCR。通常，PCR 引物与目标序列互补。但是，有些测序引物与目标序列无关。它们被称为通用引物。通用引物如 T7 或 SP6 与携带目标序列的载体退火。它们可用于各种载体和各种类型的 DNA 片段。