反相色谱和疏水相互作用色谱的区别

什么是反相色谱

反相色谱 (RPC) 是一种色谱技术，用于纯化和分析生物分子，例如蛋白质、肽和寡核苷酸。它提供高分辨率分离，是肽谱分析和纯度检查的理想选择。 RPC 更常用于肽和寡核苷酸的最终精制。

两种主要类型的疏水介质可用作固定相：覆盖有碳链的硅胶珠或裸露的疏水聚合物。柱子以填充床的形式填充有疏水介质，样品被施加到其上。可以在流动相中加入三氟乙酸 (TFA) 等离子对试剂，以增强疏水相互作用的形成。开始时使用有机改性剂，例如 5% 的乙腈，然后随着乙腈的百分比增加开始洗脱。

图 1：反相色谱理论

疏水性较小/极性较大的生物分子将首先洗脱，而疏水性较强的分子将随后洗脱。 RPC 是分辨率最高的色谱技术。

什么是疏水作用色谱

疏水相互作用色谱 (HIC) 是另一种用于基于中等条件下疏水性分离生物分子的技术。当样品必须在初始样品浓缩和净化中进行硫酸铵沉淀时，它是一种理想的蛋白质纯化技术。在硫酸铵沉淀期间升高的盐含量增加了疏水组分之间的相互作用。

图 2：高盐浓度对疏水相互作用的影响

HIC 的疏水介质由球形颗粒的惰性基质组成，该基质涂有含有烷基或芳基的配体。疏水相互作用发生在中等高盐浓度（通常为 1-2 M 硫酸铵或 3 M NaCl）下。起始缓冲液确保感兴趣的蛋白质与培养基结合，同时洗去杂质。洗脱缓冲液含有低盐浓度，削弱了蛋白质与固定相之间的相互作用。

反相色谱与疏水作用色谱之间的相似之处

反相色谱与疏水作用色谱的区别

定义

反相色谱 (RPC) 是指基于混合物中分子疏水性的最高分辨率分离技术，而疏水相互作用色谱 (HIC) 是指基于疏水性但在相对温和的条件下操作的一种分离技术。

疏水性

RPC 在更疏水的条件下运行，而 HIC 在相对温和的疏水条件下运行。

互动

反相色谱导致分子和固定相之间更强的相互作用，在洗脱过程中必须通过有机改性剂逆转，而 HIC 导致固定相和分子之间的中等高度相互作用。

疏水介质

RPC 使用碳链覆盖的二氧化硅珠粒或裸露的疏水聚合物，而 HIC 使用球形颗粒的惰性基质，该基质涂有含烷基或芳基的配体。

启动缓冲区

RPC 中的起始缓冲液使用三氟乙酸 (TFA)，而 HIC 的起始缓冲液使用中等高浓度的盐。

洗脱

增加的乙腈百分比开始在 RPC 中洗脱，而降低盐浓度开始在 HIC 中洗脱。

解析度

反相色谱是分辨率最高的色谱技术，而与 RPC 相比，HIC 的分辨率较低。

应用

RPC 用于蛋白质、肽和寡核苷酸的分离，而 HIC 主要用于蛋白质的纯化。

结论

反相色谱是分辨率最高的色谱技术，可在高度疏水的条件下运行。但是，HIC 在中等疏水条件下运行。 RPC 和 HIC 是两种基于疏水性的分离技术。 RPC 和 HIC 之间的主要区别在于每种技术中使用的疏水性程度。

参考：

1. 疏水作用和反相色谱：原理和方法。 GE 医疗保健，2006 年。可在此处获得

图片提供：

1. Nategm 的“反相梯度洗脱示意图” – 通过 Commons Wikimedia 自己的作品 (CC BY-SA 4.0) 2. Daliak 在英文维基教科书上的“Hicsalt” – 从 en.wikibooks 转移到 Commons。（公共领域）通过Commons Wikimedia